Desmond Mpilo Tutu sinh tại Klerksdorp, Transvaal, là con thứ hai và con trai duy nhất trong 3 người con của Zacheriah Zililo Tutu và bà Aletta.[2] Khi ông lên 12 tuổi thì gia đình chuyển tới cư ngụ ở Johannesburg. Cha ông làm giáo viên, còn mẹ ông làm việc quét dọn và nấu ăn ở một trường học dành cho người khiếm thị.[3] Tại đây, ông đã gặp Trevor Huddleston một mục sư coi xứ đạo Sophiatown, trong khu nhà ổ chuột của các người da đen. Tutu kể: "Một hôm, tôi đứng ở ngoài phố với mẹ tôi thì một người da trắng mặc y phục tu sĩ đi ngang qua. Khi đi ngang qua chỗ chúng tôi, ông đã bỏ mũ chào mẹ tôi. Tôi không thể tin ở mắt mình – một người da trắng đã chào một phụ nữ da đen thuộc giai cấp lao động!"[3]

Mặc dù Tutu muốn trở thành một thầy thuốc, nhưng gia đình không thể chu cấp tiền cho việc học, nên ông đành theo nghề dạy học của người cha. Tutu học ở "Pretoria Bantu Normal College" từ năm 1951 tới năm 1953, rồi dạy học ở Trường trung học Bantu Johannesburg và trường trung học Munsienville tại thành phố Mogale. Tuy nhiên, ông đã từ chức sau khi Đạo luật giáo dục Bantu được thông qua, để phản đối viễn cảnh giáo dục nghèo nàn dành cho những người da đen Nam Phi. Sau đó ông học môn Thần học ở St Peter's Theology College tại Rosettenville, Johannesburg. Năm 1960 ông được phong chức mục sư Anh giáo nối gót Trevor Huddleston, nhà hoạt động và là cố vấn tin cậy của ông.

Từ năm 1962 tới 1966 Tutu sang học ở King's College London, đậu bằng cử nhân và thạc sĩ thần học. Trong thời gian này ông làm việc bán thời gian như mục sư phó xứ, lúc đầu ở nhà thờ St. Alban, Golders Green, sau đó ở nhà thờ St. Mary tại Bletchingley, Surrey.[4] Sau đó ông trở về Nam Phi và từ năm 1967 đến năm 1972 đã dùng các bài nói chuyện của mình để làm nổi bật hoàn cảnh của dân châu Phi. Ông đã viết một bức thư gửi cho thủ tướng B.J. Vorster, trong đó ông mô tả tình hình ở Nam Phi là một "thùng thuốc súng, có thể nổ tung bất cứ lúc nào"; bức thư đó không được trả lời. Ông trở thành mục sư tuyên úy tại Đại học Fort Hare vào năm 1967, nơi đầy những người bất đồng chính kiến và là một trong vài trường đại học có chất lượng cho sinh viên châu Phi ở miền Nam châu Phi. Từ năm 1970 đến 1972, Tutu giảng dạy tại Đại học Quốc gia Lesotho.

Năm 1972, Tutu trở lại Vương quốc Anh, được bổ nhiệm làm phó giám đốc "Quỹ giáo dục Thần học" của World Council of Churches (Hội đồng các giáo hội thế giới) tại Bromley, Kent. Năm 1975, ông trở lại Nam Phi, được bổ nhiệm chức trưởng đoàn mục sư Anh giáo của Nhà thờ chính tòa thánh Maria ở Johannesburg -— người da đen đầu tiên giữ chức này.